PD-L1檢測試劑臨床試驗—結果重現性研究注冊審查指導原則

一、前言

近年來(lái)，以程序性細胞死亡蛋白1 (Programmed cell death protein 1, PD-1)/程序性死亡配體1 (Programmed death-ligand 1, PD-L1)免疫檢查點(diǎn)抑制劑為主的免疫治療在多個(gè)惡性腫瘤中取得了突破性進(jìn)展，一系列抗腫瘤藥物應用于臨床。PD-L1檢測試劑是目前應用最為廣泛的免疫治療適宜人群篩選和療效預測的生物標志物。免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC，簡(jiǎn)稱(chēng)“免疫組化”）檢測是評估腫瘤組織PD-L1表達狀態(tài)的一種有效且常用的方法，廣泛應用于多種惡性腫瘤中，以識別或輔助預測可能從免疫治療中獲益的患者。

基于免疫組化法的PD-L1檢測試劑操作程序和結果判讀較為復雜，該類(lèi)檢測試劑臨床應用的準確性與重復性是產(chǎn)品重要的臨床性能，本指導原則旨在規范產(chǎn)品檢測結果重現性臨床研究的開(kāi)展。

本指導原則是針對PD-L1檢測試劑結果重現性臨床研究的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用。該文件為供申請人和審查人員使用的指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如有能夠滿(mǎn)足法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料。本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著(zhù)法規、標準的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本文件相關(guān)內容也將適時(shí)進(jìn)行調整。

二、適用范圍

本指導原則適用于基于免疫組化法的PD-L1檢測試劑，該類(lèi)產(chǎn)品用于定性檢測人中性福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）的腫瘤組織中PD-L1蛋白的表達水平。

三、臨床試驗要求

PD-L1檢測試劑結果重現性臨床研究包括兩部分內容：環(huán)比試驗與閱片一致性研究。臨床試驗的開(kāi)展、方案的制定以及報告的撰寫(xiě)等均應符合相關(guān)法規及《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》的要求。

（一）臨床試驗設計

1．環(huán)比試驗（Ring study）

環(huán)比試驗是從病理切片開(kāi)始，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣本處理、染色及結果判讀，評價(jià)各臨床試驗機構對同一樣本集從染色到結果判斷的一致性。

環(huán)比試驗應選擇至少三家臨床試驗機構開(kāi)展，試驗所需的病例為三家臨床試驗機構共同提供的樣本組成的樣本集。在樣本集構建過(guò)程中，每家臨床試驗機構提供的陽(yáng)性病例、陰性病例及總病例數應相對均衡。每個(gè)病例應至少提供足夠三次按照申報產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測的病理切片數量。

臨床試驗牽頭單位研究者將樣本集中每一病例的病理切片分配至每家臨床試驗機構，保證每家臨床試驗機構均能夠對該病例按照申報產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行至少一次染色并報告結果。因此，每家臨床試驗機構均能對樣本集中所有病例的病理切片進(jìn)行染色及結果判讀。

各臨床試驗機構收到臨床試驗牽頭單位分配的病理切片后，選擇具有一定資歷的研究者，按照申報產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求對病理切片進(jìn)行染色及結果判讀。針對整個(gè)樣本集的染色建議盡快完成。三家臨床試驗機構通過(guò)對樣本集中病理切片進(jìn)行染色及判讀，最終各機構的數據形成環(huán)比試驗的數據集，用于后續統計分析。環(huán)比試驗設計見(jiàn)圖1。

2．閱片一致性研究

閱片一致性研究的對象為經(jīng)申報產(chǎn)品按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色的病理切片，各臨床試驗機構研究者根據產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中結果判讀方法對切片進(jìn)行判讀，評價(jià)不同研究者對染色切片判讀結果的一致性。

閱片一致性研究應選擇至少三家臨床試驗機構，研究?jì)热莅ǎ簷C構內同一病理醫師閱片一致性研究、機構內不同病理醫師閱片一致性研究、不同機構間病理醫師閱片一致性研究。各臨床試驗機構可根據臨床試驗內容，在科學(xué)設計的前提下將上述閱片一致性研究合并進(jìn)行，但應在臨床試驗方案中明確各機構不同研究者參與的具體研究?jì)热?，臨床試驗應嚴格按照臨床試驗方案進(jìn)行。

2.1機構內同一病理醫師閱片一致性研究

機構內同一病理醫師閱片一致性研究應在三家臨床試驗機構開(kāi)展，每家臨床試驗機構針對本機構所提供的臨床試驗所需的已完成染色的病理切片進(jìn)行本研究。用于臨床試驗的病理切片應包括判讀結果為陽(yáng)性的切片及判讀結果為陰性的切片。

每家臨床試驗機構選擇一名一定資歷的病理醫師對該機構入組的所有病理切片進(jìn)行3次判讀，每次判讀間隔一定的時(shí)間，同一病理醫師的不同次閱片結果組成分析數據集。機構內同一病理醫師閱片一致性試驗設計如圖2。

2.2機構內不同病理醫師閱片一致性研究

機構內不同病理醫師閱片一致性研究應在三家臨床試驗機構開(kāi)展。每家臨床試驗機構針對本機構所提供的臨床試驗所需的已完成染色的病理切片進(jìn)行本研究。用于臨床試驗的病理切片應包括判讀結果為陽(yáng)性的切片及判讀結果為陰性的切片。

每家臨床試驗機構選擇3名不同資歷的病理醫師參與臨床試驗，臨床試驗過(guò)程中由每名病理醫師對該機構入組的所有病理切片進(jìn)行判讀，所有病理醫師的閱片結果組成分析數據集。機構內不同病理醫師閱片一致性試驗設計如圖3。

2.3不同機構間病理醫師閱片一致性

不同機構間病理醫師閱片一致性研究應在三家臨床試驗機構開(kāi)展。臨床試驗所需病理切片為三家臨床試驗機構共同提供的切片組成的切片集，在切片集構建過(guò)程中，每家臨床試驗機構提供的陽(yáng)性切片、陰性切片及總切片數應相對均衡。每張病理切片應為按照申報產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色的病理切片。

各臨床試驗機構根據臨床試驗進(jìn)展開(kāi)展切片集的閱片，建議每家臨床試驗機構完成全部閱片后，再將切片集轉運至下一家機構。保證每家臨床試驗機構研究者均能對切片集中所有病例的病理切片根據產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行結果判讀。

各臨床試驗機構收到切片集后，選擇具有一定資歷的研究者，按照申報產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求對病理切片進(jìn)行結果判讀。三家臨床試驗機構對切片集中所有病理切片判讀，最終各結構的數據形成閱片一致性研究的數據集，用于后續統計分析。不同機構間病理醫師閱片一致性試驗設計如圖4。

（二）受試者選擇及樣本收集

環(huán)比試驗與閱片一致性研究入組的受試者應為產(chǎn)品預期適用人群，如待評價(jià)產(chǎn)品PD-L1檢測試劑盒預期用途為定性檢測中性福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）的食管鱗狀細胞癌（ESCC）組織中的PD-L1蛋白表達，則入組病例應為臨床明確診斷為食管鱗狀細胞癌的病例。

為了更加科學(xué)的評價(jià)產(chǎn)品性能，各部分研究均應包含部分PD-L1表達陽(yáng)性閾值臨近范圍內病例（用于指導抗腫瘤藥物使用的閾值），該部分病例所占比例應不少于陽(yáng)性病例的30%。

（三）機構和人員

臨床試驗機構應獲得國家藥品監督管理局備案認可。臨床試驗機構應具有嚴格的質(zhì)量管理體系，執行實(shí)驗室內部日常質(zhì)量控制。

臨床試驗中應根據試驗設計設定不同資歷的病理醫師參與試驗，病理醫師資歷劃分應合理。

（四）樣本量估算

臨床試驗應進(jìn)行科學(xué)的樣本量估算，建議采用參數估計的方法估算樣本量，樣本量估算過(guò)程建議設定合理置信水平和允許誤差?？刹捎萌缦鹿剑?/p>

公式中n為樣本量，Z1-α/2為置信度標準正態(tài)分布的分位數，P為評價(jià)指標預期值，Δ為P的允許誤差大小。

如研究者采用其他的合理的樣本量估算模型，在進(jìn)行合理解釋的前提下亦可采用。

1.環(huán)比試驗

各機構檢測結果的陽(yáng)性符合率應不低于85%，陰性符合率應不低于85%，置信水平取0.05。研究者應設定合理的Δ值，據此估算環(huán)比試驗所有成對比較結果中陽(yáng)性病例數及陰性病例數。在保證合理的允許誤差的前提下，臨床試驗中，環(huán)比試驗樣本集中樣本例數不應低于60例，其中陽(yáng)性不應低于30例，陰性病例不低于30。環(huán)比試驗樣本集構建過(guò)程中，提供的陽(yáng)性樣本及陰性樣本應盡量均衡。

2.閱片一致性研究

2.1機構內同一病理醫師閱片一致性研究、不同病理醫師閱片一致性研究

該部分研究應以每個(gè)臨床試驗機構為單位，進(jìn)行樣本量估算。樣本量估算過(guò)程中應選定合理的主要評價(jià)指標，如基于與參考結果的一致性評價(jià)或成對結果的一致性評價(jià)。各機構可以采用同一病理醫師多次閱片匯總統計或不同病理醫師匯總統計的陽(yáng)性一致率（或平均陽(yáng)性一致率）、陰性一致率（或平均陰性一致率）進(jìn)行陽(yáng)性及陰性病例的估算，最終入組的病例應為估算病例的1/3。樣本量估算過(guò)程應相關(guān)參數的設定應科學(xué)、合理，該部分研究臨床性能不應低于環(huán)比試驗，置信水平取0.05。研究者應設定合理的Δ值，當預期值更高時(shí)還應考慮更優(yōu)的精度。

2.2不同機構間閱片一致性研究

該部分研究應以三家機構提供的切片集進(jìn)行樣本量估算，樣本量估算過(guò)程中主要評價(jià)指標的選擇應為每家臨床試驗機構與參考方法或與其他機構對比的陽(yáng)性一致率、陰性一致率。樣本量估算過(guò)程中相關(guān)參數的設定應科學(xué)、合理，該部分研究臨床性能不應低于環(huán)比試驗，不應高于機構內同一病理醫師閱片一致性研究、不同病理醫師閱片一致性研究，置信水平取0.05。研究者應設定合理的Δ值，當預期值更高時(shí)還應考慮更優(yōu)的精度。據此估算的樣量應為本研究切片集樣本量，切片集由三家臨床試驗機構提供，各機構提供的陰性及陽(yáng)性切片的數量應相對均衡。

2.3在科學(xué)合理設計的前提下，機構內同一病理醫師閱片一致性研究、不同病理醫師閱片一致性研究及不同機構間閱片一致性研究三個(gè)研究中切片可重復使用。重復使用切片過(guò)程中應避免同一病理醫師在短時(shí)間內對同一張切片多次判讀。

（五）評價(jià)指標及統計分析

環(huán)比試驗及閱片一致性研究統計方法為一致性評價(jià)，可采用四格表分析的方法。包括與參考結果的一致性評價(jià)及成對結果的一致性評價(jià)。參考結果一般為同一樣本或同一個(gè)染色切片在不同閱片者判讀過(guò)程中，出現頻率最多的結果。與參考結果對比過(guò)程中主要評價(jià)考核試劑與參考結果的陽(yáng)性一致率（PPA）、陰性一致率（NPA）、總一致率（OA）。成對結果的一致性評價(jià)主要評價(jià)研究者兩兩成對比較的結果，成對一致性評價(jià)指標為平均陽(yáng)性一致率（APA）、平均陰性一致率（ANA）、平均總一致率（OA）。上述統計分析應采用合理的方法進(jìn)行置信區間的估算。

1．環(huán)比試驗

環(huán)比試驗的統計分析主要為各臨床試驗機構間結果的兩兩成對比較，成對分析包括以下三組：機構1與機構2、機構2與機構3、機構3與機構1。以第一組機構1與機構2成對分析為例，以機構1的結果為準，以四格表形式統計機構2結果與機構1結果的一致率，包括陽(yáng)性一致率及陰性一致率。根據上述方法分析機構2與機構3、機構3與機構1的一致率。最終將三組結果匯總，分析環(huán)比試驗的平均陽(yáng)性一致率、平均陰性一致率及平均總一致率。

2．閱片一致性研究

閱片一致性研究統計分析包括與參考結果的一致性評價(jià)及成對結果的一致性評價(jià)。

2.1 機構內同一病理醫師閱片一致性研究

與參考結果的一致性評價(jià)，每張病理切片的參考結果為本機構同一位病理醫師多次閱片結果中，出現頻率最多的結果。病理醫師單次閱片結果分別與該參考結果進(jìn)行比對，評價(jià)陽(yáng)性一致率、陰性一致率及總一致率，三次閱片結果匯總為該機構同一病理醫師閱片一致性，三家機構結果匯總為所有機構同一病理醫師閱片一致性研究。

同一病理醫師成對結果的一致性評價(jià)，評價(jià)過(guò)程包括三組：第1次閱片與第2次閱片、第2次閱片與第3次閱片、第3次閱片與第1次閱片。以第一組第1次閱片與第2次閱片成對分析為例，以第1次閱片的結果為準，以四格表形式統計第2次閱片的結果與第1次閱片結果的一致率，包括陽(yáng)性一致率及陰性一致率。根據上述方法分析第2次閱片與第3次閱片、第3次閱片與第1次閱片的一致率。最終將三組結果匯總，分析機構內同一醫生閱片的平均陽(yáng)性一致率、平均陰性一致率及平均總一致率。三家機構結果匯總為所有機構同一病理醫師閱片一致性研究。

2.2機構內不同病理醫師閱片一致性研究

與參考結果的一致性評價(jià)，每張病理切片的參考結果為本機構三位病理醫師閱片結果中，出現頻率最多的結果。具體分析方法可參考本節2.1機構內同一病理醫師閱片一致性研究。

成對結果的一致性評價(jià)，評價(jià)過(guò)程包括三組：病理醫師1與病理醫師2、病理醫師2與病理醫師3、病理醫師3與病理醫師1。具體分析方法可參考本節2.1機構內同一病理醫師閱片一致性研究。

2.3機構間病理醫師閱片一致性研究

與參考結果的一致性評價(jià)，每張病理切片的參考結果為不同機構病理醫師閱片結果中，出現頻率最多的結果。具體分析方法可參考本節2.1機構內同一病理醫師閱片一致性研究。

成對結果的一致性評價(jià)，評價(jià)過(guò)程包括三組：機構1閱片結果與機構2閱片結果、機構2閱片結果與機構3閱片結果、機構3閱片結果與機構1閱片結果。具體分析方法可參考本節2.1機構內同一病理醫師閱片一致性研究。

（六）原始數據

1.提交病例數據匯總表，內容應至少包括：性別、年齡、病理診斷結果、研究者判讀結果等。

2.提交入選樣本染色代表性彩色圖片，并對染色特點(diǎn)包括組織形態(tài)、染色強度和背景染色特點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)要評述。

（七）偏倚控制

為了控制臨床試驗的偏倚，各部分研究過(guò)程中應針對病例/切片應進(jìn)行設盲，使研究者在試驗過(guò)程中不知曉受試者疾病診斷或其他相關(guān)檢測等信息，從而避免引入偏倚。

在進(jìn)行同一病理醫師閱片一致性研究過(guò)程中，病理醫師在進(jìn)行下一次閱片時(shí)應保留一段時(shí)間的記憶清除期（脫敏期），此段時(shí)間一般不少于兩周。

同一病理醫師閱片一致性研究過(guò)程中，每次閱片時(shí)建議人為納入一定數量的不同的干擾病例。干擾病例應同時(shí)具有陽(yáng)性和陰性病例，將干擾病例混入分析組中，使研究者同時(shí)針對分析組中的病例及干擾病例進(jìn)行操作，但干擾病例結果不納入統計分析。

（八）質(zhì)量控制

臨床試驗開(kāi)始前，建議進(jìn)行相關(guān)培訓，以確保研究者熟悉并掌握相關(guān)試驗方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗誤差。整個(gè)試驗過(guò)程都應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

臨床試驗中應制定嚴格的樣本轉運方案，確保樣本轉運過(guò)程不對臨床試驗產(chǎn)生影響，樣本轉運過(guò)程中應做好樣本交接記錄，各臨床試驗機構的樣本應能夠溯源。

臨床試驗應嚴格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，應根據相關(guān)要求進(jìn)行必要的HE染色，應設置合理對照。

四、起草單位

國家藥品監督管理局醫療器械技術(shù)審評中心。

五、參考文獻

1.《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》（國家藥品監督管理局通告2021年第76號），2021年9月28日。

2.Xiao-Hua Zhou，Nancy A.Obuchowski，Donna K.McClish. 診斷醫學(xué)中的統計學(xué)方法（第二版） [M].北京:高等教育出版社，2016。

3.李衛.醫療器械臨床試驗統計方法（第二版） [M].北京:科學(xué)出版社，2016。