一、前言
　　當前，高通量測序技術(shù)（也稱(chēng)為二代測序技術(shù)）迅猛發(fā)展，已逐步廣泛應用于基因檢測的多個(gè)方面的臨床服務(wù)，其對于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和小于50bp的插入或缺失（Insertion-Deletion，InDel）變異檢測相對比較準確，但是大的結構變異檢測卻非常困難。同時(shí)，另一類(lèi)以不經(jīng)過(guò)擴增的單分子測序和長(cháng)讀長(cháng)為標志的DNA測序技術(shù)也隨即問(wèn)世，這類(lèi)測序技術(shù)被稱(chēng)為第三代測序技術(shù)。因其測序時(shí)DNA分子無(wú)需PCR擴增，實(shí)現了對每一條DNA分子的單獨測序，也稱(chēng)為單分子測序技術(shù)。

　　二、技術(shù)平臺
　　Helicos公司于2008年推出了世界上第一款單分子測序平臺HeliScope，但其讀長(cháng)較短（35bp），系統整體測序錯誤率較高（5%）。之后出現了單分子的長(cháng)讀長(cháng)測序技術(shù)，目前長(cháng)讀長(cháng)測序是指單分子測序長(cháng)度不少于 KB 級別測序讀長(cháng)的技術(shù)平臺。目前已經(jīng)實(shí)現商業(yè)化的長(cháng)讀長(cháng)測序平臺主要有Oxford Nanopore Technologies的納米孔測序平臺（Nanopore）和PacBio的單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測序平臺。
　?。ㄒ唬﹩畏肿訉?shí)時(shí)測序技術(shù)（SMRT）
　　美國太平洋生物公司（Pacific Biosciences，PacBio）開(kāi)發(fā)的三代測序技術(shù)稱(chēng)為SMRT測序（Single Molecule Real-Time Sequencing），該技術(shù)建立在兩項重要的發(fā)明基礎之上，從而攻克了測序領(lǐng)域測序讀長(cháng)短的重大難題。第一，零模波導孔技術(shù)（Zero-mode Waveguides，ZMWs）使激發(fā)光被限定在單分子納米孔底部一定范圍內，過(guò)濾了背景噪音。第二，熒光基團結合在核苷酸的磷酸基團上，幫助DNA聚合酶完成一個(gè)全天然的DNA鏈合成過(guò)程。
　　基于該原理的具體產(chǎn)品有PacBio Sequel測序儀、PacBio Sequel II測序儀。PacBio Sequel測序儀是首個(gè)商業(yè)化應用的第三代測序技術(shù)平臺，其打破傳統短讀長(cháng)測序諸多技術(shù)瓶頸。PacBio Sequel II測序儀是PacBio Sequel的升級款，可提供CLR Library和CCS library（HIFI）兩種測序模式。測序芯片上的導孔（ZMW）由100萬(wàn)個(gè)提升至800萬(wàn)個(gè)，理論通量提升8倍。CCS reads單堿基準確性有了極大提升，同一片段測序4次后，單一read的準確性可達99%。
　?。ǘ┘{米孔單分子測序技術(shù)（Nanopore）
　　納米孔單分子測序是基于電信號測序的技術(shù)，原理是通過(guò)電場(chǎng)力驅動(dòng)單鏈核酸分子穿過(guò)納米尺寸的蛋白孔道，由于不同的堿基通過(guò)納米孔道時(shí)產(chǎn)生了不同阻斷程度和阻斷時(shí)間的電流信號，由此可根據電流信號識別每條核酸分子上的堿基信息，從而實(shí)現對單鏈核酸分子的測序。由于其原理與其他平臺有較大差異，亦有被稱(chēng)為第3.5代或四代測序技術(shù)。
　　Nanopore測序儀的具體產(chǎn)品種類(lèi)很多，均為基于Nanopore芯片來(lái)搭建的平臺，大到由多個(gè)芯片陣列組成的PromehION、GridION系列測序儀，小到可以連接手機的Type C、電腦USB的MnION系列便攜式測序儀。其中PromethION是一款高通量、高樣本數的臺式系統，基于模塊化設計（多達 48 個(gè)測序芯片，各有多達 3,000 個(gè)納米孔通道，總計達 144,000 個(gè)），測序芯片既可單獨也可同時(shí)運行，尤其適合于大樣本量、具有龐大數據量的項目。
　?。ㄈ┑谌鷾y序平臺特點(diǎn)比較
　　這兩類(lèi)第三代測序平臺均具有長(cháng)讀長(cháng)、無(wú)GC偏好性及可直接檢測甲基化修飾等優(yōu)點(diǎn)。相較而言，納米孔單分子測序技術(shù)讀長(cháng)更長(cháng)，可達到Mb級別；MnION測序儀如手機大小，較為便攜；單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)（SMRT）平臺，無(wú)錯誤偏好，可通過(guò)增加數據糾錯以提高測序準確性。具體的比較如下表所示：
　　三、應用方向的探索
　　目前長(cháng)讀長(cháng)測序的三代測序平臺，已廣泛應用于復雜動(dòng)植物基因組、微生物基因組、全長(cháng)轉錄組、微生物群體研究及人類(lèi)基因組變異檢測等領(lǐng)域的科研項目中，以解決這些科研領(lǐng)域檢測技術(shù)瓶頸的問(wèn)題。
　　在疾病檢測方面，三代測序基于其單分子檢測與長(cháng)讀長(cháng)測序的特點(diǎn)，在基因組結構變異、短串聯(lián)重復/微衛星 、單體型分析 、真假基因區分 、甲基化檢測等相關(guān)的檢測中具有獨到的優(yōu)勢。例如，目前許多基于高通量測序技術(shù)的基因診斷產(chǎn)品已基本成熟；但因二代測序技術(shù)存在讀長(cháng)短、對基因組覆蓋不均勻等局限，對SNVs和 InDels檢測尚可，對復雜結構變異的檢測無(wú)能為力。第三代測序技術(shù)用于遺傳病及腫瘤基因的檢測，憑借長(cháng)讀長(cháng)、無(wú)PCR、無(wú) GC 偏好性等優(yōu)勢，進(jìn)行長(cháng)片段序列測定，可以檢測缺失、重復、倒位、易位等結構變異（＞50bp），可進(jìn)一步提高疾病的檢出率，彌補二代測序技術(shù)對結構變異檢測的不足。
　　四、小結
　　長(cháng)讀長(cháng)測序的三代測序平臺，較二代測序將讀長(cháng)提升了萬(wàn)倍，但由于錯誤率、成本及樣本要求都較高，算法、軟件、數據庫等配套的技術(shù)需要研發(fā)等問(wèn)題，目前尚處于科研項目應用階段。針對這些問(wèn)題，各技術(shù)平臺也不斷優(yōu)化技術(shù)以解決問(wèn)題，例如PacBio測序儀的HIFI技術(shù)模式可有效提高數據準確性，納米孔測序平臺也通過(guò)對PromethION進(jìn)行設備上的升級以提高準確度。
　　隨著(zhù)三代測序平臺的不斷發(fā)展，其未來(lái)在醫學(xué)領(lǐng)域的轉化應用，可以有效彌補目前基于結構變異、短串聯(lián)重復/微衛星 、單體型分析等變異的基因相關(guān)疾病的檢測手段的空白。