科普：基因編輯技術(shù)及相關(guān)IVD產(chǎn)品簡(jiǎn)介

　　基因編輯技術(shù)通常指的是利用基因編輯系統進(jìn)行分子生物學(xué)操作的技術(shù)。這里的基因編輯系統是一大類(lèi)序列依賴(lài)的基因剪切酶的統稱(chēng)，最廣泛使用為CRISPR/Cas系統，其中CRISPR全稱(chēng)clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 意為“成簇的規律間隔的短回文重復序列”；Cas指的是CRISPR-associated, 意為“與CRISPR相關(guān)的（蛋白）”，可以理解為與CRISPR相關(guān)的具備某種或某些（剪切）酶活性的蛋白。由于這個(gè)系統包含CRISPR相關(guān)的剪切蛋白，因此實(shí)現了基因的剪切-拼接，達到“編輯”的功能，因此，CRISPR也成為了基因編輯技術(shù)的代名詞。
　　基因編輯的現象最早發(fā)現于原核生物（細菌和古生菌）中，是細菌抵抗病毒的自適應免疫系統。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，其原理是細菌首次被病毒入侵時(shí)，其基因組序列整合了病毒的基因組形成了一段CRISPR，當再有外源性的病毒（質(zhì)?；蚴删w）入侵時(shí)，該段CRISPR可以識別再次入侵的外源DNA，細菌利用其自身的Cas相關(guān)蛋白切斷外源的基因組變?yōu)榫€(xiàn)性，使得病毒無(wú)法進(jìn)行復制和表達，最終被細菌體內的酶降解。
　　基因編輯系統中的CRISPR/Cas系統能夠“識別序列”并“剪切”的特性使得其成為基因編輯領(lǐng)域的良好工具，目前已發(fā)現并研究了多種CRISPR/Cas系統，包括CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12a，CRISPR/Cas13a等。特別是近幾年發(fā)現的Cas13a，Cas12a等，他們一方面具有識別并剪切目標基因的特性，還具有無(wú)差別剪切DNA/RNA的特性。根據無(wú)差別剪切DNA/RNA的特性，研究人員將DNA/RNA設計成標記有熒光報告基因和猝滅基因的報告基團，當用CRISPR/Cas12a或CRISPR/Cas13a識別目標基因并剪切目標基因時(shí)，同時(shí)剪切下來(lái)熒光報告基因，其釋放的熒光數和靶基因數量一致，這樣可以通過(guò)熒光檢測設備檢測的熒光數量來(lái)間接檢測靶基因。該項檢測通過(guò)等溫擴增及熒光閱讀儀等常規儀器即可完成，在遵循實(shí)驗室生物安全管理相關(guān)規定的前提下，應用場(chǎng)景廣泛。
　　目前已有多種有關(guān)IVD檢測應用研究的文章發(fā)表，總結來(lái)說(shuō)，這類(lèi)發(fā)表的方法通常先從人體樣本中提取目標核酸（如病毒的DNA或RNA），Cas經(jīng)過(guò)一段先導RNA（gRNA, guide RNA）的設計引導其配對至目標核酸序列位置，通過(guò)RPA（Recombinase Polymerase Amplification，重組酶聚合酶擴增）擴增（一種等溫擴增技術(shù)，最佳反應溫度37℃）放大其中目標基因的濃度，隨后采用基因編輯技術(shù)進(jìn)行剪切并釋放熒光信號，進(jìn)而對熒光信號進(jìn)行檢測。例一，采用CRISPR/Cas12a識別單鏈DNA開(kāi)發(fā)的檢測人體樣本中人乳頭瘤病毒HPV 16和18的試劑，也叫做DETECTR（ DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）；例二，國外的張峰團隊結合前期研究開(kāi)發(fā)了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）方法，該方法基于Cas13a酶，采用RPA擴增技術(shù)和RNA引導Cas13a進(jìn)行信號剪切，該技術(shù)熒光信號是連接在RNA上的，利用Cas13酶的附帶的無(wú)差別剪切RNA的功能，實(shí)現信號釋放，該團隊認為開(kāi)發(fā)產(chǎn)品的難點(diǎn)在于提取純化Cas13；例三，其他團隊采用另外一種更簡(jiǎn)便快速的樣本處理方式HUDSON(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）處理諸如咽拭子、唾液、尿液等樣本并結合SHERLOCK方法，已證實(shí)可以很好地檢出如寨卡病毒、登革病毒、黃病毒等RNA病毒，由于HUDSON僅是通過(guò)加熱免提取處理臨床唾液或尿液樣本，拋開(kāi)了繁復的核酸提取過(guò)程，今后有望應用于POCT現場(chǎng)檢測，或可供WHO采購用在實(shí)驗條件有限的國家和地區；例四，還有團隊開(kāi)發(fā)了用于人基因組單核苷酸多態(tài)性（SNP，single nucleotide polymorphism）的檢測方法等。
　　新冠病毒同屬于RNA病毒，自去年疫情爆發(fā)以來(lái)， FDA 在2020年5月EUA（for Emergency Use Authorization only，僅限于緊急授權使用）首次批準了張峰團隊開(kāi)發(fā)的基因編輯IVD產(chǎn)品——SHERLOCK方法學(xué)定性檢測人體上呼吸道樣本中的新冠病毒N基因和ORF1ab基因，從檢索批準文件和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上看，該產(chǎn)品是一個(gè)僅限在實(shí)驗室使用而非可以廣泛使用的產(chǎn)品，需要采用Thermo公司的RNA提取試劑盒嚴格地進(jìn)行核酸提取純化步驟來(lái)完成，并非如文獻報道的那樣采用加熱免提取來(lái)處理臨床樣本如唾液、咽拭子等。分析性能方面，該產(chǎn)品最低檢出限N基因為1.35copies/ul VTM，ORF1ab基因為6.75copies/ul VTM，整個(gè)從提取至檢測出結果時(shí)間不超過(guò)2小時(shí)。
　　國內目前已有進(jìn)入優(yōu)先/應急審評的國產(chǎn)基因編輯方法學(xué)的新冠病毒檢測產(chǎn)品中，已批準的產(chǎn)品2個(gè)，處于溝通交流及資料完善中的產(chǎn)品1個(gè)，從現有資料看，采用的基因編輯系統一種為國內廠(chǎng)商使用的CRISPR/Cas13a以及Cas12a系統，與國際研究相符，因為Cas13或Cas12除了靶向剪切目標核酸序列外，還附帶有無(wú)差別剪切核酸信號的功能。另外，國內廠(chǎng)商都是通過(guò)外購獲得Cas13a和Cas12a這兩種剪切蛋白，并未具有自行制備的能力。第二種為有自己自主知識產(chǎn)權的科研院所和企業(yè)合作，轉化為相應基因編輯方法學(xué)的新冠病毒檢測產(chǎn)品，比如中國科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪院士團隊，其研究者采用的是CRISPR/Cas12b剪切系統，該系統是我國自主研發(fā)并申請了國際、國內專(zhuān)利，目前產(chǎn)品已完成注冊檢驗，處于溝通交流及資料完善階段。目前國產(chǎn)產(chǎn)品從批準和完成的注冊檢驗的情況來(lái)看，可以滿(mǎn)足新冠病毒國家參考品和臨床使用的要求，根據產(chǎn)品不同，最低檢出限在450copies～1000copies左右。
　　從CRISPR/Cas系統的發(fā)現到臨床實(shí)踐的應用及探索，除了最初帶給人類(lèi)上帝之手的驚喜之外，研究人員逐漸認識到了該系統家族應用的優(yōu)、缺點(diǎn)，目前仍在不斷地進(jìn)行改造和應用于不同的領(lǐng)域，隨著(zhù)近年Cas13及Cas12的發(fā)現，相較早先的Cas9基因編輯系統具有更好的準確性，解決了脫靶效應（即未嚴格按照設計要求剪切）問(wèn)題，同時(shí)其附帶的無(wú)差別剪切功能契合了體外診斷中需要釋放檢測信號的需求，總體來(lái)說(shuō)CRISPR應用到IVD是一個(gè)劃時(shí)代的發(fā)現，可以稱(chēng)作是新的診斷技術(shù)，其精準性和快速性逐漸得到了科研人員的認可。
　　準確、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟一直是IVD開(kāi)發(fā)的目標，但就目前已在臨床應用的產(chǎn)品來(lái)看，CRISPR技術(shù)和傳統的成熟PCR相比還未顯現明顯優(yōu)勢，PCR的最低檢出限和檢測速度甚至可以超越CRISPR。一個(gè)新技術(shù)需要一定時(shí)間的成熟和發(fā)展，也需要越來(lái)越多的臨床應用反饋來(lái)改進(jìn)，因此，隨著(zhù)提取技術(shù)、等溫擴增技術(shù)的應用以及更新更好的Cas蛋白的發(fā)現，CRISPR技術(shù)是否能超越傳統PCR，是否如發(fā)表文獻所說(shuō)的有專(zhuān)屬的應用場(chǎng)景還有待觀(guān)察。
　　審評關(guān)注點(diǎn)：gRNA設計，靶序列的識別信號剪切的驗證與對應關(guān)系，脫靶效應，最低檢出限，檢測所需時(shí)間等。

     （原創(chuàng ) 2021-10-14 CMDE 中國器審）

標簽：體外診斷試劑注冊