引言：近日，國家藥監總局醫療器械技術(shù)審批中心發(fā)布《地中海貧血基因突變檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則（征求意見(jiàn)稿）》，就該醫療器械注冊審評相關(guān)事項面向社會(huì )公眾公開(kāi)征求意見(jiàn)。

根據國家藥品監督管理局2019年度醫療器械注冊技術(shù)指導原則制修訂計劃的有關(guān)要求，我中心組織起草了《地中海貧血基因突變檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則》。經(jīng)文獻匯集、企業(yè)調研、專(zhuān)題研討和專(zhuān)家討論，形成了征求意見(jiàn)稿。

為使該指導原則更具有科學(xué)合理性及實(shí)際可操作性，即日起在網(wǎng)上公開(kāi)征求意見(jiàn)，衷心希望相關(guān)領(lǐng)域的專(zhuān)家、學(xué)者、管理者及從業(yè)人員提出意見(jiàn)或建議，推動(dòng)指導原則的豐富和完善。

請將意見(jiàn)或建議以電子郵件的形式于2019年11月10日前反饋我中心。

聯(lián)系人：劉容枝、韓從音

電話(huà)：010-86452532；010-86452531；

電子郵箱：liurz@cmde.org.cn
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附件：1. 地中海貧血基因突變檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則（征求意見(jiàn)稿）（下載）

    2. 反饋意見(jiàn)表（下載）

國家藥品監督管理局

醫療器械技術(shù)審評中心

2019年10月18日

附件1

地中海貧血基因突變檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則

（征求意見(jiàn)稿）

本指導原則旨在指導醫療器械注冊申請人對地中海貧血基因突變檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評部門(mén)對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導原則是對地中海貧血基因突變檢測試劑的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學(xué)依據，并依據產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內容進(jìn)行充實(shí)和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規強制執行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究和驗證資料，相關(guān)人員應在遵循法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著(zhù)法規和標準的不斷完善以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導原則相關(guān)內容也將適時(shí)進(jìn)行調整。

一、范圍

地中海貧血（簡(jiǎn)稱(chēng)地貧）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于珠蛋白基因發(fā)生突變（點(diǎn)突變或缺失等），致使珠蛋白肽鏈合成減少或完全不能合成而導致的一組單基因遺傳性溶血性疾病，輕者可無(wú)臨床表現，重者以進(jìn)行性溶血性貧血為主要特征。根據珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類(lèi)型，地貧分為α，β和γ地貧等，臨床上最常見(jiàn)的是α和β地貧。地貧主要分布在地中海沿岸、東南亞和少數非洲地區，具有明顯的種族特性和地域分布差異。地貧是我國南方地區最常見(jiàn)、危害最大的遺傳病之一，尤以廣西、云南、廣東、海南、四川和貴州等省份為甚，云南、海南和廣東的地貧人群攜帶率可達10%以上，廣西更是達到了20%以上。

α地貧主要是由于α-珠蛋白基因發(fā)生突變而引起。α珠蛋白基因簇位于16p13.3，包括2個(gè)胎兒期和成人期表達基因（α2和α1），基因的排列順序為5’-α2-α1-3’。根據單倍型的情況，可將α地貧分為3類(lèi)：（1）缺失型α⁺地貧（-α/），缺失1個(gè)α基因；（2）缺失型α⁰地貧（--/），2個(gè)α基因同時(shí)缺失；（3）非缺失型α⁺地貧（α^Tα/或αα^T/），1個(gè)α1或α2基因發(fā)生點(diǎn)突變或少數幾個(gè)堿基的缺失。中國現已發(fā)現至少19種α珠蛋白基因大片段缺失和38種α珠蛋白基因點(diǎn)突變。其中，6種α珠蛋白基因突變：--^SEA/、-α^3.7/、-α^4.2/、α^WSα/（HBA2:c.369C>G）、α^QSα/（HBA2:c.377T>C）；α^CSα/（HBA2:c.427T>C）占患病人群總數的98%。

α地貧基因型和臨床分型的關(guān)系已經(jīng)基本闡明。α地貧的表型嚴重程度隨著(zhù)功能性α珠蛋白基因的減少而加重：（1）1個(gè)α基因缺失或點(diǎn)突變（-α/αα或αα^T/αα或α^Tα/αα），稱(chēng)為靜止型α地貧，通常不貧血，血液學(xué)表現為小細胞低色素；（2）2個(gè)α基因缺失或復合α基因點(diǎn)突變，或點(diǎn)突變，其基因型為--/αα或-α/-α或-α/αα^T或α^Tα/-α或α^Tα/α^Tα，稱(chēng)為輕型α地貧，臨床表現α地貧特征，血液學(xué)檢查有小細胞低色素特征；（3）3個(gè)α基因缺失或復合α基因點(diǎn)突變，基因型為--/-α或--/α^Tα，稱(chēng)為中間型α地貧，又稱(chēng)Hb H病，患者有中重度貧血。某些基因型為α^Tα/α^Tα的病例（如α^CSα/α^CSα、α^QSα/α^QSα和α^CSα/α^QSα）也表現為Hb H病。通常，--/α^Tα的非缺失型 Hb H病較單純缺失型Hb H?。?/span>--/-α）的臨床表現更為嚴重，特別是基因型為--/α^CSα或--/α^QSα的Hb H病患者，貧血程度較為嚴重；（4）4個(gè)基因缺失，其基因型為--/--，稱(chēng)為重型α地貧，又稱(chēng)Hb Bart’s胎兒水腫綜合征，此類(lèi)個(gè)體一般無(wú)法存活到出生或分娩后半小時(shí)內死亡。

β地貧是由于β珠蛋白基因發(fā)生點(diǎn)突變或缺失而引起，以點(diǎn)突變?yōu)橹?，少數為缺失型?/span>β珠蛋白基因簇位于11p15.3，包括2個(gè)成人期表達基因（β和δ），基因的排列順序為5’-δ-β-3’。根據β珠蛋白鏈合成量的程度，可將β地貧分為3類(lèi)：（1）β⁰地貧，β珠蛋白鏈完全不能合成，其所在的等位基因稱(chēng)為β⁰地貧等位基因；（2）β⁺地貧，β珠蛋白鏈合成減少，其所在的等位基因稱(chēng)為β⁺地貧等位基因；（3）β⁺⁺地貧，又稱(chēng)沉默型β地貧，β珠蛋白鏈合成輕微減少。中國已報道84中β珠蛋白基因點(diǎn)突變和11種β珠蛋白基因缺失。其中，6種點(diǎn)突變：HBB:c.126_129delCTTT，HBB:c.52A>T，HBB:c.-78A>G，HBB: c.79G>A，HBB: c.316-197C>T和HBB: c.216_217insA占了全部突變類(lèi)型的90%以上。

β地貧的臨床表型可分為4種：（1）靜止型β地貧，基因型為β⁺⁺/β^N，血液學(xué)表型正?；蚺R界，一般只能通過(guò)分子診斷識別；（2）輕型β地貧，基因型為β⁰/β^N或β⁺/β^N，臨床表現為小細胞低色素和HB A2值升高；（3）中間型β地貧，基因型為β⁺/β⁺或β⁺/β⁰，表型變異范圍大，可從輕度貧血到中度貧血，多于幼兒期出現中度貧血；（4）重型β地貧，基因型為β⁺/β⁰或β⁰/β⁰，通常伴有嚴重貧血，需要定期輸血才能存活?；純撼錾鷷r(shí)無(wú)癥狀，常于嬰兒期（3-12月齡）發(fā)病。如不治療，患兒多于5歲前死亡。此外，中間型的分子基礎較為復雜，顯性β地貧突變的雜合子（β^D/β^N），合并α地貧突變的β地貧突變純合子（β⁰/β⁰），或合并α珠蛋白三聯(lián)體的β地貧突變雜合子（β⁰/β^N或β⁺/β^N），也會(huì )顯示中間型的表型。

2018年發(fā)布的《重型β地中海貧血的診斷和治療指南》明確規定：對于重型β地中海貧血的診斷，有條件者均應進(jìn)行基因診斷，基因型為純合子或復合雜合子為確診本病的指標。2018年發(fā)布的《兒童非輸血依賴(lài)型地中海貧血的診治和管理專(zhuān)家共識》也明確規定：地貧基因檢測為非輸血依賴(lài)型地貧的診斷依據之一。

另外，國家衛生計生委發(fā)布的相關(guān)文件要求：為減少重型地貧患兒出生，在我國地貧高發(fā)省份實(shí)施地貧防控試點(diǎn)項目。主要流程包括：（1）對新婚夫婦和計劃懷孕夫婦在懷孕前或孕期進(jìn)行血常規常規初篩；（2）對夫婦一方或雙方血常規檢查結果陽(yáng)性的夫婦進(jìn)行血紅蛋白分析復篩；（3）對血紅蛋白分析復篩結果均為陽(yáng)性的夫婦，取其抗凝靜脈全血進(jìn)行相應的α+β地貧基因檢測；（4）綜合夫婦雙方病史詢(xún)問(wèn)、地貧篩查和基因檢測結果，判定為高風(fēng)險夫婦。對高風(fēng)險夫婦進(jìn)行追蹤，及時(shí)了解受檢婦女懷孕情況，指導女方在懷孕后適宜時(shí)期接受產(chǎn)前診斷。產(chǎn)前診斷的對象為胎兒，樣本類(lèi)型為胎兒的絨毛、羊水和臍帶血，檢測項目為相應的β地貧基因檢測。

綜上，結合該類(lèi)產(chǎn)品臨床使用的實(shí)際情況，本指導原則的預期用途可為：用于體外定性檢測人外周靜脈全血或胎兒羊水等樣本中基因組DNA的α和/或β地貧基因突變或缺失，用于：α和/或β地貧的遺傳診斷，或地貧高風(fēng)險夫婦的評估，或胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷。

結合該類(lèi)產(chǎn)品在中國注冊的實(shí)際情況以及當前的認知，本指導原則僅對“α和/或β地貧的遺傳診斷”預期用途的相關(guān)內容進(jìn)行了詳細闡述。針對其他兩個(gè)預期用途，本指導原則僅對部分內容進(jìn)行了闡述，申請人應根據產(chǎn)品特性，對本指導原則未涉及的內容進(jìn)行補充評價(jià)。

本指導原則的技術(shù)要求是基于PCR探針?lè )ǚ椒ń⒌?，對于其他分子生物學(xué)檢測技術(shù)（如：PCR-反向點(diǎn)雜交法和gap-PCR法等），可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標不夠全面，申請人可以根據產(chǎn)品特性對不適用部分進(jìn)行或補充其他的評價(jià)和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導原則適用于進(jìn)行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結果的總結評價(jià)以及國內外同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹等內容。其中，同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹部分應著(zhù)重從方法學(xué)、檢驗原理、檢測的缺失和/或突變類(lèi)型以及臨床意義等方面詳細說(shuō)明申報產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準的同類(lèi)產(chǎn)品之間的主要區別。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原總局令第5號，以下簡(jiǎn)稱(chēng)《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（原總局公告2014年第44號），以下簡(jiǎn)稱(chēng)《44號公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應成分、質(zhì)控品及企業(yè)參考品的研究資料。

1. 此類(lèi)產(chǎn)品的主要反應成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測所需引物、探針、酶、dNTP、反應緩沖液等。申請人應提交相關(guān)原材料的選擇、制備和質(zhì)量標準等的研究資料。如為申請人自制，應提交詳細的工藝穩定性研究資料；如為外購，還應提交供應商篩選資料以及供應商提供的原材料質(zhì)量檢定報告。

1.1 核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。

1.2 引物、探針

申請人應詳述引物、探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。建議設計多套引物探針以供篩選，針對待測位點(diǎn)的特異性等進(jìn)行評價(jià)，選擇最佳設計，并提交詳細的篩選研究數據。

申請人應針對選定的引物、探針原材料進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標記基團的激發(fā)波長(cháng)和發(fā)射波長(cháng)，以及功能性試驗等，并依據評價(jià)結果建立合理的質(zhì)量標準。

1.3酶

酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請人應針對各種酶的活性進(jìn)行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質(zhì)量標準。

DNA聚合酶應具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內切酶活性，具熱穩定性。UDG/UNG應具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內切酶活性。

1.4脫氧三磷酸核苷（dNTP）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應提交對其純度、濃度、保存穩定性等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質(zhì)量標準。

2. 質(zhì)控品

試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設置各種試劑盒質(zhì)控品來(lái)實(shí)現。

質(zhì)控品可分別設置野生型、雜合型及純合突變型DNA樣品（至少包含代表性的突變類(lèi)型和突變位點(diǎn)），同時(shí)設置不含待測靶序列的空白質(zhì)控品用于交叉污染的質(zhì)控；也可直接采用常見(jiàn)突變類(lèi)型和突變位點(diǎn)的雜合型樣品及空白質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制。

如該類(lèi)產(chǎn)品所采用的方法學(xué)和檢驗原理顯示：無(wú)論檢測何種樣本（野生型、雜合突變和純合突變），其反應體系均可出現陽(yáng)性反應，均可對管內抑制導致的假陰性結果進(jìn)行質(zhì)量控制，則無(wú)需另外設置內標；否則，試劑盒應另外設置內標。

質(zhì)控品可采用質(zhì)?；蛉嘶蚪MDNA等?？瞻踪|(zhì)控品應參與樣本核酸的平行提取。申請人應提供質(zhì)控品原料選擇、制備、定值過(guò)程等的詳細研究數據，并對質(zhì)控品的檢測結果做出明確的范圍要求。

3. 企業(yè)參考品

企業(yè)參考品主要包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和精密度參考品等。申請人應提交企業(yè)參考品的原料選擇、制備方法、基因序列確認及檢驗標準的詳細研究資料等。

3.1 陽(yáng)性參考品：可采用臨床樣本或其核酸提取液，如采用臨床樣本，則樣本類(lèi)型應與待測樣本一致。應至少包含野生型和所有檢測位點(diǎn)的雜合型樣本，同時(shí)盡量納入純合突變型樣本。對于某些稀有基因型，需要時(shí)也可采用細胞系代替。

3.2 陰性參考品：應考慮檢測特異性的評價(jià)，納入易產(chǎn)生交叉反應的同源序列樣本和干擾樣本等。

3.3檢測限參考品可選擇最低檢測限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近最低檢測限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本或其核酸提取液，至少包含所有檢測位點(diǎn)的雜合型樣本。

3.4 精密度參考品應至少包括所有檢測位點(diǎn)的低濃度雜合突變型臨床樣本或其核酸提取液。

目前，該類(lèi)產(chǎn)品已有國家參考品，企業(yè)參考品的要求應不低于國家參考品。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標記（如有）等工藝過(guò)程的描述及確定依據。生產(chǎn)過(guò)程應對關(guān)鍵參數進(jìn)行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細說(shuō)明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標準。

反應體系研究指反應條件的選擇確定過(guò)程，包括樣本采集、預處理（如有）、樣本用量、試劑用量、核酸提取純化步驟、PCR反應條件、閾值循環(huán)數（Ct值）等的確定。

不同適用機型的反應條件如有差異應分別提交。

（四）分析性能評估資料

申請人應針對下述各項分析性能提交詳細的評估資料，包括試驗地點(diǎn)、適用儀器、試劑規格、批號、試驗方法、試驗樣本（類(lèi)型、來(lái)源、數量、處理方法、基因型和濃度確認等）、可接受標準、統計方法、試驗數據及結論等。分析性能評估的實(shí)驗方法可以參考國內外有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導原則。

每項性能評估應盡量采用與適用樣本類(lèi)型一致的臨床樣本，對于某些稀有基因型，也可采用細胞系等。

1. 核酸提取/純化性能（如有）

在進(jìn)行靶核酸檢測前，應有適當的核酸提取/純化步驟。該步驟應最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無(wú)論檢測試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請人都應對配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度等做充分的驗證，并評價(jià)該方法能否滿(mǎn)足該類(lèi)產(chǎn)品的要求。

2. 檢測準確性

建議采用若干份臨床樣本驗證該類(lèi)產(chǎn)品的檢測準確性，樣本類(lèi)型與說(shuō)明書(shū)聲稱(chēng)的樣本類(lèi)型一致。樣本應涵蓋野生型、所有檢測位點(diǎn)的雜合突變型和純合突變型。對于某些稀有基因型，也可采用細胞系代替。

3. 最低檢測限

該類(lèi)產(chǎn)品的最低檢測限可定義為：在滿(mǎn)足一定的檢測準確性和精密度的條件下，能夠檢出目標序列的最低人基因組DNA的濃度?？刹捎锰荻葷舛鹊娜嘶蚪MDNA樣本進(jìn)行多次重復檢測，確定適當檢出率水平（如：95%）下的最低人基因組DNA濃度。檢測限評價(jià)建議采用臨床樣本或細胞系，并至少包含所有檢測位點(diǎn)的雜合突變型。應明確臨床樣本或細胞系與人基因組DNA濃度的對應關(guān)系。

4. 分析特異性

4.1 應針對同源序列進(jìn)行交叉反應驗證，說(shuō)明交叉反應樣本的制備方法、核酸序列確認方法，提交詳細的驗證資料。

4.2 應針對可能的內源和外源性干擾物進(jìn)行干擾試驗研究。內源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白、母體細胞的干擾等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑和常用藥物等；

干擾試驗可通過(guò)在臨床樣本中人工添加干擾物質(zhì)的方式，評價(jià)干擾物質(zhì)對目標序列檢測的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進(jìn)行干擾試驗評價(jià)。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進(jìn)行評價(jià)；如有干擾，應確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

5. 精密度

精密度評價(jià)應采用臨床樣本進(jìn)行試驗，試驗操作完全按照說(shuō)明書(shū)執行，包含核酸提取/純化等步驟（如有）。樣本應至少涵蓋所有檢測位點(diǎn)的雜合突變型。

精密度評價(jià)需滿(mǎn)足如下要求：

5.1對可能影響檢測精密度的主要因素進(jìn)行驗證，除檢測試劑本身外，還包括分析儀、操作者、地點(diǎn)、時(shí)間、檢測輪次和試劑批次等。

5.2設定合理的精密度評價(jià)周期，對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價(jià)。如有條件，申請人應選擇不同的實(shí)驗室進(jìn)行重復實(shí)驗以對室間重復性進(jìn)行評價(jià)。

5.3用于精密度評價(jià)的臨床樣本至少設置低濃度和中/高濃度水平。

5.4精密度指標可設置為CV等，申請人應對精密度指標評價(jià)標準做出合理要求。

（五）陽(yáng)性判斷值確定資料

建議納入一定數量的臨床樣本，應包括所有檢測位點(diǎn)的各種基因型（野生型、雜合突變型和純合突變型），采用受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)或其他合理方法確定陽(yáng)性判斷值。

如試劑判讀存在灰區，應解釋說(shuō)明灰區范圍的確定方法。

對于某些檢測方法學(xué)，陽(yáng)性判斷值研究可能不適用，申請人應說(shuō)明理由。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要包括申報產(chǎn)品的穩定性研究和適用樣本的穩定性研究?jì)刹糠?。前者主要包括申報產(chǎn)品的實(shí)時(shí)穩定性、開(kāi)瓶/復溶穩定性、運輸穩定性及凍融次數限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件和保存時(shí)間等的研究。

實(shí)時(shí)穩定性研究應采用至少三批樣品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后，選取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)品性能評價(jià)，從而確定產(chǎn)品保存條件和有效期。

如核酸提取液可保存，還需對核酸提取液的保存條件和保存時(shí)間進(jìn)行研究。

（七）臨床試驗

應滿(mǎn)足《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求，如相關(guān)法規、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。下面僅說(shuō)明該類(lèi)產(chǎn)品臨床試驗中應關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。

（一）針對“α和/或β地貧的遺傳診斷”預期用途

1．臨床試驗機構及人員

申請人應根據產(chǎn)品特點(diǎn)及預期用途，綜合不同地區人種和流行病學(xué)背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規要求的臨床試驗機構開(kāi)展臨床試驗。

2. 臨床試驗適用人群和臨床樣本

具有地貧癥狀和/或體征、血液學(xué)表現為小細胞低色素的疑似地貧患者；需與地貧進(jìn)行鑒別診斷的其他疾病患者，如：缺鐵性貧血、鐵粒細胞性貧血或先天性紅細胞生成異常性貧血等。

臨床試驗所用樣本應為臨床外周抗凝靜脈全血臨床樣本，基因組DNA非臨床樣本。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應同時(shí)滿(mǎn)足申報產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)、對比試劑說(shuō)明書(shū)（如適用）及第三方試劑說(shuō)明書(shū)（如適用）的相關(guān)要求。

3. 臨床試驗方法

3.1已有同類(lèi)產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

對于已批準的α地貧突變或缺失（α^CS、α^QS、α^WS、--^SEA/、-α^3.7和-α^4.2/Thai）以及β地貧突變或缺失（41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、14-15M、27/28M、31M、37M、43M、-29M、-30M、-32M、-50M/N、IntM、IVS-I-1M、IVS-I-5M），選擇已上市同類(lèi)產(chǎn)品作為對比試劑，評價(jià)申報產(chǎn)品的臨床檢測性能。

3.2無(wú)同類(lèi)產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

3.2.1 如新突變位點(diǎn)的臨床意義已獲行業(yè)認可（如：國內相關(guān)指南或專(zhuān)家共識），且上述認可基于充分的中國人群的臨床數據，則臨床試驗可選擇sanger基因測序（針對新的點(diǎn)突變）或臨床普遍使用的其他公認方法（針對其他類(lèi)型的新突變位點(diǎn)，如缺失）作為對比方法，評價(jià)新突變位點(diǎn)的臨床檢測性能。除此之外，還應提交新位點(diǎn)臨床意義已獲行業(yè)認可的相關(guān)證據，但該部分資料可不納入臨床方案和報告。

3.2.2 如新突變位點(diǎn)的臨床意義未獲行業(yè)認可，則臨床試驗應包括兩個(gè)目的，新突變位點(diǎn)的臨床檢測性能評價(jià)和臨床意義的評價(jià)。新突變位點(diǎn)的臨床檢測性能評價(jià)可參考3.2.1；新突變位點(diǎn)臨床意義的評價(jià)應提交基于中國人群的充分的臨床證據，證明基因型與表型的關(guān)系，如：隨訪(fǎng)或其他可證明基因型與表型關(guān)系的臨床驗證資料。該部分新突變位點(diǎn)臨床意義的評價(jià)應納入臨床方案和報告。

4. 最低樣本量和陽(yáng)性例數

臨床試驗樣本量應采用適當的統計學(xué)方法進(jìn)行估算，并詳細描述所使用統計方法及各參數的確定依據。

4.1 臨床檢測性能評價(jià)的樣本量估算

臨床檢測性能評價(jià)的樣本量估算，建議采用單組目標值法計算臨床試驗的最低樣本量，通過(guò)陽(yáng)性符合率計算所需陽(yáng)性樣本的例數，通過(guò)陰性符合率計算所需陰性樣本的例數，同時(shí)考慮脫落情況，計算最低樣本總量。陽(yáng)性符合率和陰性符合率的目標值（臨床可接受的最低標準）建議均不低于98%。

所有突變位點(diǎn)應均具有適當數量的陽(yáng)性例數，常見(jiàn)突變位點(diǎn)的陽(yáng)性例數應分別滿(mǎn)足統計學(xué)要求，罕見(jiàn)突變位點(diǎn)也應有一定的陽(yáng)性例數，以便臨床性能得到充分驗證。

4.2 新位點(diǎn)臨床意義評價(jià)的樣本量估算

新位點(diǎn)臨床意義評價(jià)的樣本量估算，建議采用抽樣調查公式或其他合理方法進(jìn)行估算。

（二）針對“地貧高風(fēng)險夫婦的評估”和“胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷”預期用途

針對上述兩個(gè)預期用途，本指導原則僅對部分內容進(jìn)行了闡述，申請人應根據產(chǎn)品特性，充分考慮本指導原則未涉及的內容，設計科學(xué)合理的臨床試驗進(jìn)行評價(jià)。

1.      臨床試驗機構和人員

如申報產(chǎn)品的預期用途為胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷，臨床試驗機構還應為已取得產(chǎn)前診斷技術(shù)服務(wù)資質(zhì)的醫療機構。人員應為經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)培訓的取得資質(zhì)的人員。機構和人員應遵循《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》《母嬰保健專(zhuān)項技術(shù)服務(wù)許可及人員資格管理辦法》，機構取得《母嬰保健技術(shù)服務(wù)執業(yè)許可證》，人員取得《母嬰保健技術(shù)考核合格證書(shū)》。

2、臨床試驗適用人群和臨床樣本

如預期用途為地貧高風(fēng)險夫婦的評估，則適用人群為：地貧表型篩查陽(yáng)性，或需進(jìn)行地貧基因檢測的其他人群（主要為地貧高發(fā)地區計劃懷孕夫婦）。

如預期用途為胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷，則適用人群為：地貧高風(fēng)險夫婦的胎兒。地貧高風(fēng)險夫婦的確定可參考衛技委等相關(guān)文件。

臨床試驗所用樣本應為胎兒羊水等臨床樣本，基因組DNA非臨床樣本。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應符合衛計委等相關(guān)文件的要求，并同時(shí)滿(mǎn)足產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求。

3. 最低樣本量和陽(yáng)性例數

針對兩種不同的預期用途，應分別采用合理方法估算最低樣本量。同一預期用途的不同樣本類(lèi)型（羊水和臍帶血等），也應分別采用合理方法估算最低樣本量。

（三）不同預期用途的通用要求

1. 臨床試驗方法、數據及統計分析

1.1應在臨床試驗方案或報告中明確申報產(chǎn)品、對比試劑和第三方試劑的試驗方法。

1.2臨床試驗病例總結表應以列表方式表示，包括申報產(chǎn)品的結果、對比試劑的結果、第三方試劑的檢測結果（如有）、臨床診斷、年齡和性別等。

1.3以交叉表分別總結兩種試劑的定性檢測結果，選擇合適的統計方法進(jìn)行統計分析，以驗證兩種試劑檢測結果的一致性。

1.4 結果差異樣本的驗證

在數據收集過(guò)程中，對于兩種試劑檢測結果不一致的樣本，采用合理方法進(jìn)行復核，并對差異原因進(jìn)行分析。如無(wú)需復核，應說(shuō)明理由。

2. 臨床試驗方案

各臨床試驗機構的方案設置應基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗過(guò)程中遵循預定的方案，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗過(guò)程應在臨床試驗機構的實(shí)驗室內并由本實(shí)驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導外，不得隨意干涉實(shí)驗進(jìn)程。

試驗方案應確定嚴格的入選/排除標準，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗操作過(guò)程和結果判定時(shí)，應采用盲法以保證試驗結果的客觀(guān)性。各臨床試驗機構選用的對比試劑/方法應保持一致，以便進(jìn)行合理的統計學(xué)分析。另外，申報產(chǎn)品的樣本類(lèi)型不應超越對比試劑/方法對樣本類(lèi)型的要求。

3. 臨床試驗報告

應對試驗的整體設計及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應該對整個(gè)臨床試驗實(shí)施過(guò)程、結果分析、結論等進(jìn)行條理分明的描述，并應包括必要的數據和統計分析方法。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應符合《辦法》、《44號公告》和《醫療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的相關(guān)要求。該類(lèi)產(chǎn)品作為三類(lèi)體外診斷試劑，應將主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求等內容作為附錄附于技術(shù)要求正文后。

目前，該類(lèi)產(chǎn)品已有行業(yè)標準，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應不低于行業(yè)標準的要求。

（九）產(chǎn)品檢驗報告

根據《辦法》的要求，第三類(lèi)體外診斷試劑申請注冊時(shí)應提交連續三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的檢驗報告。目前，該產(chǎn)品已有國家參考品，產(chǎn)品注冊檢驗應滿(mǎn)足國家參考品的要求。

（十）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)應滿(mǎn)足《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料的相關(guān)研究結果保持一致。下面對該類(lèi)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內容進(jìn)行闡述。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：

1.1本產(chǎn)品用于定性檢測人xx樣本基因組DNA中的α和/或β地貧xx突變或xx缺失，用于：α和/或β地貧的遺傳診斷，或地貧高風(fēng)險夫婦的評估，或胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷。

1.2介紹地貧相關(guān)的臨床背景信息及實(shí)驗室診斷方法等、介紹被測靶標（基因缺失或/和突變位點(diǎn)）的相關(guān)情況。

2.【主要組成成分】

2.1說(shuō)明試劑盒包含組分的名稱(chēng)、數量、比例或濃度等信息，說(shuō)明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業(yè)應列出相關(guān)試劑/耗材的名稱(chēng)、貨號及其他相關(guān)信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應在此注明經(jīng)過(guò)驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱(chēng)以及產(chǎn)品貨號和醫療器械備案號（如有）等詳細信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒的被測靶標進(jìn)行詳細描述（基因位置、缺失或/和突變位點(diǎn)及相關(guān)特征等），對試劑盒所用探針、引物、突變或缺失的判定終點(diǎn)等進(jìn)行詳細介紹；對不同樣本反應管組合、質(zhì)控品設置及熒光信號檢測原理等進(jìn)行介紹。

3.2試劑盒技術(shù)原理的詳細介紹，建議結合適當圖示進(jìn)行說(shuō)明。如反應體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理進(jìn)行適當介紹。

4.【儲存條件及有效期】

說(shuō)明試劑盒的效期穩定性等，應明確具體的儲存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、運送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限以及運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復至室溫，凍融次數的限制等。

6.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導用戶(hù)操作。

7.【檢驗方法】

詳細說(shuō)明實(shí)驗操作的各個(gè)步驟，包括：

7.1實(shí)驗條件：實(shí)驗室分區、實(shí)驗環(huán)境的溫度、濕度和空調氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用），對核酸提取純化環(huán)節進(jìn)行合理質(zhì)控，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時(shí)間設置、循環(huán)數設置或相應的自動(dòng)化檢測程序及相關(guān)注意事項。

7.6儀器設置（如適用）：特殊參數、探針的熒光素標記情況、對待測樣本及其他質(zhì)控品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗結果的解釋】

結合質(zhì)控品、樣本管檢測結果以及檢測類(lèi)型，以列表形式詳述所有可能出現的結果及相應的解釋。如存在檢測灰區，應詳述對于灰區結果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1申報產(chǎn)品僅對下述檢測類(lèi)型xx進(jìn)行了驗證。

9.2有關(guān)假陰性結果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過(guò)度降解均有可能導致假陰性結果。

9.2.2未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì )導致假陰性結果（如有）。

10.【產(chǎn)品性能指標】簡(jiǎn)述以下性能指標：

10.1最低檢測限：簡(jiǎn)單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結果。

10.2陽(yáng)性/陰性參考品符合率。

10.3精密度：簡(jiǎn)單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應驗證：同源性序列等交叉反應驗證。

10.4.2干擾物質(zhì)驗證：樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對檢測結果的影響。

10.5對比試驗研究（如有）：簡(jiǎn)要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統計學(xué)方法及統計分析結果。

11.【注意事項】應至少包括以下內容：

11.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實(shí)驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實(shí)驗室管理辦法》現行有效版本等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗室、臨床基因擴增實(shí)驗室的管理規范執行。