體外診斷試劑參考區間確定注冊審查指導原則

本指導原則旨在指導醫療器械注冊申請人對注冊申報資料中參考區間研究資料的準備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評部門(mén)審評注冊申報資料提供參考。

本指導原則是對體外診斷試劑參考區間確定的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學(xué)依據，并依據產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內容進(jìn)行充實(shí)和細化。

本指導原則是供醫療器械注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，應在遵循相關(guān)法規的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。

本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著(zhù)法規、標準體系的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導原則相關(guān)內容也將適時(shí)進(jìn)行調整。

一、適用范圍

本指導原則適用于定量檢測體外診斷試劑參考區間的確定研究。本文主要討論健康人群相關(guān)的參考區間，申請人也可用類(lèi)似方法建立其他類(lèi)型參考人群的參考區間，如其他特定生理或病理條件的參考區間。

本指導原則不適用于定性和半定量檢測試劑；不適用于藥物濃度監測用途的檢測試劑；不適用于致病性病原體相關(guān)檢測試劑；不適用于醫學(xué)決定水平的確定。已經(jīng)有國內公認、統一的參考區間和醫學(xué)決定水平的檢測項目，可不再建立參考區間，此類(lèi)產(chǎn)品應將評估重點(diǎn)放在標準化方面。

本指導原則適用于進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品注冊和變更注冊的體外診斷試劑參考區間確定，包括申報資料中的部分要求，其他未盡事宜，應當符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》（國家市場(chǎng)監督管理總局令48號）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《辦法》）等相關(guān)法規要求。

二、基本原則

應按照以下情況,分別選擇建立和驗證的方式確定申報產(chǎn)品的參考區間：

1.首個(gè)申報產(chǎn)品（境內無(wú)同類(lèi)已批準上市注冊產(chǎn)品）

1.1境內申報產(chǎn)品應通過(guò)建立的方法，確定申報產(chǎn)品的參考區間。

1.2進(jìn)口申報產(chǎn)品，如在境外申請人注冊地或者生產(chǎn)地所在國家（地區）已批準上市，申請人需驗證申報產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)載明的參考區間的適用性。如驗證不通過(guò)，需建立適用于中國人群的參考區間。未在境外申請人注冊地或生產(chǎn)地所在國家（地區）上市的創(chuàng )新醫療器械，應建立包含中國人群參考區間。

2.國內已有同類(lèi)產(chǎn)品批準上市的申報產(chǎn)品，可選擇自行建立參考區間，也可以選擇驗證該產(chǎn)品境外注冊試劑說(shuō)明書(shū)中的參考區間（進(jìn)口注冊適用），或其他國內已注冊產(chǎn)品參考區間，但應首選注冊申報中臨床試驗或臨床評價(jià)中方法學(xué)比對時(shí)，所選擇的對比試劑的參考區間進(jìn)行驗證。如驗證通過(guò)，可直接采用經(jīng)驗證的參考區間；如驗證不通過(guò)，應建立參考區間。

上述參考區間的驗證應滿(mǎn)足下文“（二）參考區間的驗證”章節相關(guān)條件；參考區間的建立應滿(mǎn)足下文“（一）參考區間的建立”章節相關(guān)要求。

三、技術(shù)審查要點(diǎn)

（一）參考區間的建立

1.參考樣本組的選擇

1.1制定參考個(gè)體的選擇標準

篩選參考個(gè)體時(shí)，應首先確定檢測項目的適用人群，除成年表觀(guān)健康人外，適用時(shí)，也應考慮納入未成年人（如評估生長(cháng)發(fā)育的指標）或老年人（如評估衰老相關(guān)疾病的指標），絕經(jīng)前和絕經(jīng)后表觀(guān)健康女性個(gè)體（如部分女性相關(guān)腫瘤標志物、骨代謝標志物等），不同月經(jīng)周期女性（如性激素）等；對于特定體液樣本類(lèi)型，如腦脊液，可考慮將非相關(guān)病理人群的特定評估指標作為參考個(gè)體的篩選標準。應根據申報產(chǎn)品個(gè)性化定義“表觀(guān)健康”，評估可能的生理及病理影響因素，據此設定明確的納入、排除標準。應依據納入、排除標準設計參考個(gè)體調查問(wèn)卷，并采取必要的措施保證問(wèn)卷填寫(xiě)的準確、客觀(guān)。

綜上，針對不同檢測項目參考個(gè)體的排除標準也不盡相同，表1中列出應予以考慮的部分排除因素，申請人應根據檢測項目的不同，增加或減少排除標準。

表1 參考個(gè)體選擇應考慮的排除因素

1.2制定參考個(gè)體的分組標準

根據所篩選參考個(gè)體的特征，考慮其是否對臨床決策具有意義等情況，對其進(jìn)行分組。研究者應根據檢測項目的不同，合理設計分組條件。潛在分組條件可以是年齡、性別、血型、種族、晝夜節律、飲食、吸煙、運動(dòng)、月經(jīng)周期、妊娠階段、采樣時(shí)間、地理位置、職業(yè)等因素。

1.3 參考個(gè)體的選擇

參考個(gè)體選擇時(shí)，應按照明確的標準采用直接抽樣的方式進(jìn)行選擇。參考個(gè)體應盡可能接近檢測項目的臨床患者分布組成，盡可能涵蓋各年齡組內不同年齡段，且男女個(gè)體數量應相當(適用時(shí)），地域選擇應具有代表性。參考個(gè)體分布特征應盡量接近社區人群分布。注冊申請人根據產(chǎn)品特點(diǎn)設計納入、排除標準，將符合標準的具有人群代表性的個(gè)體納入參考人群。建議通過(guò)多中心招募的形式納入參考人群。

2.樣本采集與處理

2.1參考個(gè)體準備

參考個(gè)體的狀態(tài)指對檢測項目結果具有影響的狀態(tài)。樣本采集前進(jìn)食會(huì )對許多檢測項目有直接（濃度改變）或間接（脂類(lèi)物質(zhì)干擾）的影響，長(cháng)期節食也會(huì )造成許多檢測指標的改變。另外，咖啡因、酒精、香煙和維生素C等，也會(huì )對許多檢測項目的檢測結果產(chǎn)生影響。因此，應該對參考個(gè)體各項可能產(chǎn)生影響的因素（表2）進(jìn)行評價(jià)，保證狀態(tài)良好方可進(jìn)行樣本的采集。

表2 參考個(gè)體的狀態(tài)因素

2.2樣本的采集、處理和儲存

影響參考樣本采集、處理和儲存的因素包括采樣環(huán)境、采樣時(shí)間、采樣體位、樣本類(lèi)型、運送方式、樣本狀態(tài)、樣本分離、儲存方式等。申請人應采用符合說(shuō)明書(shū)聲稱(chēng)要求的樣本進(jìn)行參考區間研究，并在研究報告中詳細說(shuō)明樣本類(lèi)型、儲存方式等情況。如檢測采用血液樣本，應區分動(dòng)脈血、靜脈血及毛細血管血；如需使用抗凝劑，需明確抗凝劑的類(lèi)型；如采集尿液樣本應明確取樣時(shí)間段（如適用）。

3.樣本檢測

應采用檢測系統進(jìn)行參考樣本的檢測。檢測系統包括樣本處理用產(chǎn)品、檢測試劑、校準品、質(zhì)控品、檢測設備等。

4.數據分析

依據臨床意義的不同，參考區間研究需要確定檢測項目的單側界值或雙側界值。通常使用雙側2.5%～97.5%人群分布，單側時(shí)可選擇95%或5%。

4.1參考樣本數量

研究至少需要120例參考樣本,此時(shí)可對參考限的90%置信區間進(jìn)行準確估計。參考限的置信區間不同，所需參考樣本量也不盡相同，具體見(jiàn)表3。如需分組評估，則每組均需要滿(mǎn)足相應置信區間的參考樣本量要求。如有離群值，則應在剔除離群值后補足相應參考樣本例數。 

表3 95%參考區間的不同置信區間最少樣本數量

 4.2繪制分布圖

繪制分布圖用以了解數據分布特征，并對數據進(jìn)行審查。

為了解數據的分布特性，需對數據是否呈正態(tài)分布進(jìn)行判斷，即數據對稱(chēng)性和正態(tài)峰的判斷。數據對稱(chēng)性和正態(tài)峰的判斷可通過(guò)直方圖、正態(tài)概率圖，或采用假設檢驗的方法進(jìn)行綜合判斷，常用的假設檢驗方法有矩法、W檢驗法、KS檢驗法等。

4.3數據離群值的判斷

申請人應采用合理的統計分析方法進(jìn)行離群值的判定。此處推薦兩種方法：

4.3.1 Dixon方法（適用于非正態(tài)分布數據）

4.3.1.1在參考值檢測數據中，如果有疑似離群數據，應將疑似離群值的檢測結果和其相鄰值的差D和數據（包含疑似離群值）全距R相除，若D/R≥1/3考慮為離群值。

4.3.1.2若同側有2個(gè)或以上疑似離群點(diǎn)，可從最小的疑似離群點(diǎn)起作如上處理，若D/R都大于1/3，則所有疑似點(diǎn)都定義為離群值；若D/R都小于1/3，則保留所有疑似數據。

4.3.2 Tukey法（適用于正態(tài)分布數據）

4.3.2.1 計算數據集的四分位數，定義為Q3（75%分位數）和Q1（25%分位數）。計算四分位間距，定義為IQR(Q3-Q1)。將大于四分位間距上限：Q3+1.5×IQR或小于四分位間距下限：Q1-1.5×IQR的參考值定義為離群值。

4.3.3如出現離群值，應對離群值產(chǎn)生原因進(jìn)行分析，如果有明確的原因，如檢測時(shí)操作錯誤等，可將離群值剔除，如無(wú)明確原因，應將該數據保留。

4.4數據分組

數據是否需要分組，需根據參考區間分組是否對臨床決策具有意義或檢測項目具有明確的生理學(xué)意義，且必須對不同亞組之間的差別進(jìn)行統計學(xué)假設檢驗，檢驗結果應顯示差異有統計學(xué)意義。

申請人應結合數據分布特征選擇適當的統計假設方法進(jìn)行數據分組判定。如數據呈正態(tài)分布，申請人可采用Z檢驗，確定分組后的均值間差異有無(wú)統計上的顯著(zhù)性。

式中，

1——第一組參考值的均值

2——第二組參考值的均值

s1 ——第一組參考值的標準差

s2 ——第二組參考值的標準差

n1——第一組參考值的數量

n2 ——第二組參考值的數量

n——平均樣本量

如s2＞1.5s1或s2/（s2-s1）＜3時(shí)，可以考慮分組；如計算Z值超過(guò)Z*時(shí)，也可考慮成分組。

4.5建立參考區間

依據數據分布特征，計算參考區間的常用方法包括參數法和非參數法。

4.5.1經(jīng)正態(tài)性檢驗后，如參考值數據近似正態(tài)分布或檢測數據經(jīng)變量轉換后呈正態(tài)分布，可采用正態(tài)分布法確定參考區間，樣本量要求見(jiàn)表3。用該方法確定的參考區間所得結果穩定，受兩端數據影響較小。

可采用下述公式進(jìn)行參考區間的計算：

雙側1-α參考區間：`X±Z1-α/2S

單側1-α參考區間：＞`X -Z1-αS或＜`X＋Z1-αS

式中`X為均數，S為標準差。

4.5.2經(jīng)正態(tài)性檢驗后，如參考值數據呈偏態(tài)分布，可采用百分位數法（非參數法）確定參考區間，樣本量要求見(jiàn)表3。該方法受兩端數據影響較大，樣本含量較小時(shí)結果不穩定、不宜選用。將n個(gè)參考個(gè)體檢測值按照從小到大的順序排列，并依次編上秩次。把n個(gè)秩次分為100等分，與r%秩次對應的數稱(chēng)為第r百分位數，用Pr表示。分別計算參考值下限r1（2.5百分位數）和參考值上限r2（97.5百分位數）作為檢測項目的95%參考區間。還需計算參考限的90%或95%置信區間。若r值計算值不是整數，可將它們四舍五入后取整。

（二）參考區間的驗證

1.驗證條件

采用驗證的方法確定申報試劑參考區間時(shí)，需要滿(mǎn)足以下條件：第一，原始參考區間的研究應系統全面，具有可信性，如已發(fā)布實(shí)施的臨床檢測參考區間標準等;第二，檢測系統需具有可比性；第三，參考區間研究的分析前因素需具有可比性，如參考個(gè)體的狀態(tài)，標本采集和處理程序等; 第四，參考人群的適宜性。原始參考區間研究所采用的參考人群應在人群分布的地理位置、人口統計學(xué)特征等方面與申報試劑預期適用人群相一致，或包含符合參考區間建立參考樣本數量要求的上述參考人群。如不能同時(shí)滿(mǎn)足上述條件，申請人需按照前文所述方法建立自己的參考區間。

申請人應通過(guò)方法學(xué)比對的方法，對申報產(chǎn)品與原始參考區間建立時(shí)的檢測系統的可比性進(jìn)行研究。方法學(xué)比對研究方法，可參考《免于臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價(jià)技術(shù)指導原則》（國家藥品監督管理局2021第74號公告）。注意兩檢測系統檢測結果應具有高度一致性。申請人應通過(guò)列表的方式，對比參考人群分布的地理位置、生物特征、參考區間研究分析前的因素等。

2.參考區間的驗證

申請人應選擇至少20例與申報產(chǎn)品預期使用人群地理分布和人口統計學(xué)特征相似的參考個(gè)體，在具有與原始參考區間研究一致的分析前因素和相同的檢測條件下，研究小樣本人群的參考值。比較小樣本參考值和原始參考區間之間的可比性。如果20例參考個(gè)體中只有不超過(guò)2例的參考值超出原始參考區間，即通過(guò)驗證，可以直接使用原始參考區間。如參考個(gè)體多于20例，則超出原始參考區間的數據不超過(guò)檢測結果的10%，即通過(guò)驗證；若有10%以上的數據超出原始參考區間，則應另選至少20例參考個(gè)體，重新按照上述判斷標準進(jìn)行驗證。若參考區間驗證使用了其他參考界值，則對應的驗證標準需滿(mǎn)足統計學(xué)要求的。若驗證結果符合要求，可直接使用原始參考區間，反之則應檢查所有的分析程序，考慮樣本是否有生物學(xué)差異，并按照前文所述方法建立自己的參考區間。

在統計學(xué)上，隨著(zhù)樣本量的增加，利用統計原理發(fā)現人群差異的能力更強。因此，申請人可以加大參考個(gè)體的樣本量，如采用60例樣本，并將測得的參考值與原始參考區間比較，判斷參考值和原始參考區間之間是否具有可比性。

（三）說(shuō)明書(shū)

申請人應在說(shuō)明書(shū)【參考區間】中載明經(jīng)研究確定的參考區間。此部分內容應包含參考區間確定的基本信息，包括：樣本量、參考人群特征（如性別、年齡、種族等）和參考區間確定采用的統計學(xué)方法。

四、其他應注意的問(wèn)題

無(wú)論是建立自己的參考區間或驗證參考區間，都要確保參考區間的可溯源性，記錄確定參考區間的所有步驟，包括參考個(gè)體的選擇、分析前因素、樣本檢測以及統計分析方法等。

五、名詞解釋

1.參考個(gè)體（reference individual）：根據明確標準選擇出進(jìn)行實(shí)驗的個(gè)體。通常是符合特定標準的健康個(gè)體。

2. 參考人群（reference population）：由所有參考個(gè)體組成的群體。

注：通常情況下參考人群中的個(gè)體數是未知的，因此參考人群是一個(gè)假設實(shí)體。

3.參考樣本組（reference sample group）：從參考人群中選出的用以代表參考人群的足夠數量的個(gè)體。

4.參考值（reference value）：通過(guò)對參考個(gè)體某一特定量進(jìn)行觀(guān)察或測量而得到的值（檢驗結果）。

5.參考分布（reference distribution）：一組參考值的分布。

6.參考限（reference limit）：源自參考值的分布，用于描述部分參考值的位置（小于或等于、大于或等于、上限/下限）。

7.參考區間（reference interval）：來(lái)自生物參考人群的數值的特定分布區間。

注：在有些情況下，只有一端的生物學(xué)參考界限是重要的，通常是上限“x”，相應的參考區間將是小于或等于“x”。

六、參考文獻

[1] GB/T 29791.1-2013，體外診斷醫療器械制造商提供的信息（標示）第1部分：術(shù)語(yǔ)、定義和通用要求[S].

[2] CLSI. Defining, Establishing, and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory; Approved Guideline—Third Edition. CLSI document EP28-A3c. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2010.

[3] WS/T 402-2012，臨床實(shí)驗室檢驗項目參考區間的制定[S].

[4] WS/T 780-2021，兒童臨床常用生化檢驗項目參考區間[S].